Medicina / Ciências Médicas e da Saúde

Dissertações de Mestrado

Resumo

Introdução: A WNK1 (With-No lysine Kinase 1) é uma serina-treonina cínase recentemente descoberta, cujas mutações são responsáveis por uma rara forma de hipertensão arterial, de transmissão autossómica dominante, designada Hipertensão Hipercaliémica Familiar (HHF) ou Síndrome de Gordon. A WNK1 possui duas isoformas: uma longa (long WNK1, L-WNK1) que poderá activar o co-transportador Na-Cl (NCC – Na-Cl cotransporter), o canal epitelial de sódio (ENaC – epithelial sodium channel) e inibir o canal de potássio (ROMK – renal outer medulla potassium channel), e uma isoforma renal (kidney specific WNK1 – KS-WNK1) que poderá regular a actividade da isoforma longa, através de um mecanismo dominante-negativo. A expressão de KS-WNK1 varia em resposta as alterações da dieta: a expressão de mRNA da KS-WNK1 aumenta nos rins de ratinhos submetidos a uma dieta rica em potássio ou infusão crónica de aldosterona, enquanto as variações no conteúdo em sódio parecem não ter efeito na expressão de KS-WNK1. Desta forma, três condições diferentes, mas todas caracterizadas por elevados níveis de aldosterona, têm diferentes efeitos na regulação da expressão de KS-WNK1. Estes resultados sugerem que a aldosterona estimula a expressão de KS-WNK1, mas que um segundo estímulo, possivelmente a angiotensina II, regula negativamente a sua expressão em condições de baixa ingestão de sódio. O objectivo deste projecto foi o estabelecimento de um modelo celular no qual os efeitos da aldosterona e da angiotensina II na expressão das isoformas de WNK1 pudessem ser testados e posteriormente caracterizados, uma vez que a identificação destas vias de sinalização in vivo se tem demonstrado frequentemente difícil.
Materiais e métodos: O nível de expressão de mRNA de L-WNK1 e KS-WNK1 foi quantificado por real-time RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction), em células da linha celular Madin-Derby Canine Kidney (MDCK) com sobre-expressão do receptor mineralocorticóide humano (hMR), na presença ou ausência de aldosterona.
Resultados: Inicialmente foi feita a caracterização da expressão do receptor mineralocorticóide (hMR) e da KS-WNK1 nas células MDCK, de forma a validar o modelo MDCK como um modelo adequado para o estudo da regulação da expressão da WNK1 pela aldosterona. Foi demonstrado que a KS-WNK1 é expressa em baixo nível nas células MDCK, e que a sua expressão diminui com o aumento do número de ciclos celulares. O hMR é também expresso em baixo nível nesta linha celular. Deste modo, este modelo poderá ser utilizado para o estudo da estimulação da KS-WNK1 pela aldosterona, mas não no estudo da sua inibição pela angiotensina II. Relativamente à regulação da expressão das isoformas de WNK1 pela aldosterona, em células MDCK com sobreexpressão do hMR, foi demonstrado que a aldosterona estimula não apenas a expressão do mRNA da KS-WNK1, mas também da L-WNK1.
Conclusões: O efeito estimulador da aldosterona sobre a expressão do mRNA de KS-WNK1 nas células MDCK é concordante com estudos prévios realizados no modelo celular Cortical Collecting Duct (CCD). No entanto, o nosso estudo é o primeiro a descrever um efeito estimulante relativamente ao efeito da aldosterona na expressão de LWNK1. Estes dados discordam de resultados prévios obtidos in vitro (no nefrónio distal, sensível à aldosterona) e in vivo, e podem sugerir que a L-WNK1 é expressa ao longo de todo o nefrónio, num baixo nível, e não especificamente no nefrónio distal, sensível à aldosterona. Um aumento na expressão de L-WNK1 pela aldosterona num único segmento do nefrónio, tal como o tubo contornado distal, poderia deste modo ser marcarado pela expressão global de L-WNK1. Dados recentes sugerem que outro modelo celular (mpkDCT - mouse distal convoluted tubule) poderá constituir uma outra possibilidade no estudo da regulação da expressão de WNK1 pela angiotensina II, o qual não parece ser possível utilizando o modelo MDCK.

 

Índice

I. Abstract
II. Introduction

1. Arterial hypertension: genes and environment
2. With no Lysine Kinases (WNK) and arterial hypertension
3. WNK1: Structure and functions
4. Regulatory mechanisms of WNK1 expression

4.1. Promoters and enhancers
4.2. Regulation of WNK1 by sequences in intron 1
4.3. Regulation by dietary electrolyte intake and aldosterone

5. Project

III. Material and methods

1. Preparation of plasmidic DNA
2. Transient Cell Transfection
3. RNA extraction
4. Real-time RT-PCR 
5. Reporter gene assays

IV. Results

1. Plasmids preparation
2. Expression of the mineralocorticoid receptor in MDCK cell s
3. KS-WNK1 is expressed at a low level in MDCK cells
4. KS-WNK1 and L-WNK1 expression is increased in the presence of aldosterone

V. Discussion

VI. Bibliography
 

 

Resumo

Abstract

Tese