Medicina / Ciências Médicas e da Saúde

Dissertações de Mestrado

Resumo

A possibilidade de analisar amostras com quantidades exíguas de material genético (amostras Low Copy Number ou LCN), em que estão presentes apenas algumas células, tem alterado a forma de encarar a cena do crime. Alguns vestígios que até agora não eram considerados como susceptíveis de proporcionarem resultados, podem actualmente ser analisados com sucesso. As impressões digitais são um bom exemplo. Estes vestígios apresentam um baixo número de células, permitindo apenas recuperar quantidades de DNA inferiores a 100 pg. Assim, para a análise do DNA nuclear, é necessário implementar sistemas muito sensíveis que consistem, habitualmente, no aumento do número de ciclos da PCR. Contudo, alguns artefactos são produzidos, tornando difícil a interpretação dos electroforectogramas. Neste trabalho pretendeu-se comparar a aplicação do estudo de STR autossómicos, Y-STR e miniSTR na análise genética de impressões digitais, partindo do conceito do aumento do número de ciclos como estratégia para se obter maior sensibilidade. Procedeu-se também à amplificação total do genoma e nested-PCR, como métodos alternativos ao aumento do número de ciclos. Adicionalemente, neste estudo tentou-se perceber a influência dos principais métodos reveladores de impressões digitais (cianoacrilato, pó magnético e pó branco) na análise do DNA. Os resultados mostram que o aumento do número de ciclos é a melhor opção como método para aumentar a sensibilidade. Constata-se também que o DNA extraído de impressões digitais encontra-se parcialmente degradado, obtendo-se diferenças significativas entre loci com fragmentos de amplificação menores e maiores do que 200 pb. Dos diferentes marcadores caracterizados verifica-se que, em termos de percentagem de alelos detectados, os miniSTR proporcionam os melhores resultados. Por outro lado, os Y-STR parecem altamente sensíveis à degradação ou presença de inibidores, pelo que são menos robustos para este tipo de análises. Verifica-se também que os perfis LCN são drasticamente afectados por artefactos, principalmente os derivados de variação estocástica, como o allele dropout e o desequilíbrio heterozigótico. A determinação de perfis de consenso permite reduzir alguns destes artefactos. Dos métodos de revelação estudados, o cianoacrilato é o que apresenta menor influência na análise e, pelo contrário, o pó branco provoca os resultados mais negativos.

 

Palavras chave: Impressões Digitais, DNA, Low Copy Number, miniSTR, STR, Y-STR, Nested-PCR, WGA.

 

Índice

1 Introdução

1.1 Breve introdução à genética forense

1.1.1 Marcadores STR

1.1.2 Marcadores miniSTR

1.1.3 Marcadores SNP

1.1.4 O DNA mitocondrial

1.2 Impressões digitais como fonte de DNA

1.2.1 Impressões digitais – amostras low copy number

1.2.2 Os dedos como vectores por excelência

1.2.3 Factores de variação da deposição das células

1.3 Análise genética de amostras LCN

1.3.1 Análise LCN – STR

1.3.1.1 Amplificação por PCR

1.3.1.2 MiniSTR e impressões digitais

1.3.1.3 Artefactos da análise LCN

1.3.2 Recolha e extracção de DNA LCN

1.3.3 Reveladores de impressões digitais latentes

1.4 Transferência transversal de DNA

1.4.1 Transferência adventícia

1.4.2 Transferência secundária

1.4.3 Contaminação

1.4.3.1 Na cena do crime

1.4.3.2 No laboratório forense

1.4.4 Hierarquia das proposições e LCN

1.5 Validação estatística da análise LCN

1.6 Análise genética vs análise lofoscópica

2 Material e Métodos

2.1 Testes de sensibilidade

2.1.1 Identifiler™

2.1.2 Yfiler™

2.1.3 MiniSTR

2.1.3.1 Heptaplex e Triplex

2.1.3.2 Amplificação por PCR

2.1.3.3 Construção de ladders alélicos

2.1.4 WG

2.1.5 Detecção e análise dos fragmentos de amplificação

2.2 Optimização do método de extracção

2.2.1 Amostra

2.2.2 Extracção

2.2.2.1 Método de extracção simples (Schiffner et al., 2005)

2.2.2.2 Resina Chelex® - Microcon

2.2.2.3 Método QIAamp/QIAshredder (Sinclair & McKechnie, 2000)

2.2.2.4 Extracção orgânica (PC)

2.2.3 Amplificação e análise dos fragmentos

2.2.4 Quantificação

2.2.5 Protocolo PC adaptado a amostras LCN

2.3 Análise genética de impressões digitais

2.3.1 Amostras

2.3.2 Revelação das impressões digitais

2.3.3 Extracção do DNA

2.3.4 Amplificação por PCR

2.3.4.1 Identifiler™

2.3.4.2 Yfiler™

2.3.4.3 MiniSTR

2.3.4.4 Nested-PCR

2.3.4.5 Amplificação total do genoma

2.3.5 Detecção e análise dos fragmentos de amplificação

2.3.6 Quantificação

2.3.7 Controlo de qualidade

2.3.8 Análise dos resultados

2.3.9 Microscopia

3 Resultados

3.1 Testes de sensibilidade

3.1.1 Identifiler™

3.1.2 Yfiler™

3.1.3 MiniSTR

3.1.4 WGA

3.2 Método de extracção

3.3 Análise de impressões digitais

3.3.1 Identifiler™

3.3.1.1 Número de ciclos

3.3.1.2 Métodos de revelação

3.3.1.3 Alelos contaminantes

3.3.1.4 Exposição ao ambiente

3.3.1.5 Loci menores e maiores que 200 pb

3.3.1.6 Hb, allele e locus dropout

3.3.1.7 Stutters

3.3.1.8 Consenso

3.3.2 Yfiler™

3.3.2.1 Número de ciclos

3.3.2.2 Loci maiores e menores que 200 pb

3.3.2.3 Métodos de revelação

3.3.2.4 Alelos contaminantes

3.3.3 MiniSTR

3.3.4 WGA

3.3.5 Nested-PCR

4 Discussão

4.1 Testes de sensibilidade

4.2 Extracção de DNA

4.3 Análise genética de impressões digitais

5 Conclusões
 

 

Abstract

Resumo

Tese