Transformação Genética de Plantas
Existem duas barreiras físicas que impedem
a entrada de DNA estranho no núcleo de uma célula vegetal: a parede
celular e a membrana citoplasmática. A maioria dos métodos de
transformação de plantas ultrapassa estas duas barreiras recorrendo a
abordagens físico-químicas. Este métodos podem ser divididos em:
· Métodos indiretos – envolvem a
utilização de organismos que funcionam como vetores de transmissão do
DNA que se deseja inserir na célula;
· Métodos diretos – existe contato direto
entre o DNA estranho e a célula que se deseja transformar.
A transformação de células vegetais com
Agrobacterium tumefaciens é considerado um método
indireto. Esta bactéria do solo gram-negativa possui um plasmídeo
especial – plasmídeo Ti – que funciona como veículo para a introdução de
DNA estranho nas células vegetais. Originalmente, o plasmídeo Ti é
responsável pela produção de tumores nas plantas, que são consequência
da transferência, integração e expressão de genes (contidos num segmento
específico do plasmídeo – o T-DNA) no genoma da célula vegetal. Este
processo infecioso inicia-se devido à existência de um ferimento na
planta, o que permite a união da bactéria à superfície da célula
vegetal. Como resposta ao ferimento, as plantas libertam compostos
fenólicos que vão induzir a expressão dos genes vir, presentes no
plasmídeo Ti. Os produtos destes genes são essenciais para que ocorra a
transferência e a integração do T-DNA no genoma da célula. Após a
integração do T-DNA, inicia-se a expressão dos seus genes (oncogenes e
genes responsáveis pela síntese de opinas, que irão levar à formação do
tumor).
Utilizando as características originais do
plasmídeo Ti, é possível desenhar um T-DNA que contenha um gene que
permitirá selecionar as plantas transformadas e o gene de interesse a
introduzir no genoma que queremos alterar. Os genes responsáveis pela
formação dos tumores são removidos, assim como os genes que produzem
fitohormonas. A transformação com Agrobacterium consiste nos
seguintes passos:
1. Cultivo da bactéria que contém o gene
de interesse com os explantes;
2. Cultivo dos explantes infetados em meio
de regeneração que contém um agente seletivo, que permite eleger as
plantas transformadas, e um antibiótico que irá reduzir o crescimento
bacteriano;
3. Seleção dos rebentos resistentes ao
agente seletivo;
4. Se possível, verificar a veracidade da
transformação realizando um ensaio para o gene inserido;
5. Enraizamento dos rebentos que foram
transformados.
A transformação de protoplastos é
um método direto de introdução de DNA numa célula vegetal. Este envolve
a digestão enzimática da parede celular originando-se protoplastos
(células vegetais sem parede celular) que são mantidos em meio de
cultura osmoticamente controlado. A introdução do DNA na célula pode
ocorrer pela aplicação de um campo elétrico, que induz a formação
transitória de poros na membrana citoplasmática, por aplicação de um
choque químico ou pela microinjeção do DNA no seu interior. A entrada da
nova informação genética pode ser facilitada pela adição de agentes
permeabilizantes da membrana, que também auxiliam a incorporação do DNA
por um processo de neutralização das cargas deste dentro da célula. Ao
contrário da transformação por Agrobacterium, esta técnica não
apresenta limitações quanto ao hospedeiro que se quer transformar, desde
que os sistemas vegetais sejam capazes de regenerar plantas a partir de
protoplastos. No entanto, este tipo de transformação pode levar à
integração de múltiplas cópias e rearranjos do DNA estranho.
Outro método direto de transformação de
plantas é através do bombardeamento de partículas ou método
biolístico. Neste caso são utilizadas pequenas partículas de metal
(tungsténio ou ouro) cobertas com o DNA que se pretende introduzir na
célula, que depois são aceleradas com um gás sob pressão, penetrando o
tecido vegetal. O DNA pode ser inserido em vários compartimentos
celulares aleatoriamente. Este método tem como vantagens a possibilidade
de transformação de tecidos organizados, um maior número de células
alteradas (a dispersão da informação genética introduzida é homogénea),
a transformação de espécies recalcitrantes (plantas cuja regeneração
in vitro é difícil ou impossível) e o estudo de processos básicos em
plantas (com a introdução de genes marcadores cromogénicos). Contudo,
apresenta uma baixa taxa de sucesso, as espécies vegetais exibem um
elevado número de cópias do DNA estranho e é um método bastante oneroso.
A transformação das plantas pode ser
confirmada e caracterizada quanto à sua eficiência, recorrendo-se a
diversos métodos de biologia molecular. Por exemplo, a presença do
transgene no genoma vegetal pode ser confirmada através de
Southern-blotting ou de PCR e a confirmação da sua transcrição e
acumulação dos transcritos pode ser realizada por Northern-blotting, por
RT-PCR (reação em cadeia da polimerase pela transcriptase reversa) ou
por hibridação in situ.
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