Conceito de Southern Blot
Southern blot diz respeito a uma técnica
utilizada na Biologia Molecular através da qual é possível verificar se
uma sequência de DNA específica (gene de interesse) está ou não presente
na amostra em análise que contem uma mistura complexa (genoma inteiro de
um organismo). Com esta técnica é, também, possível obter informações
sobre a massa molecular e a quantidade relativa existente dessa
sequência de DNA específica. O seu nome foi dado em homenagem ao seu
inventor, Edwin Southern, um biólogo inglês que desenvolveu a técnica em
1970 na Universidade de Edimburgo. A técnica baseia-se na separação de
fragmentos de DNA por peso molecular através de uma electroforese,
seguindo-se a transferência para uma membrana e a detecção do fragmento
de DNA de interesse por hibridação com uma sonda específica.
Procedimento:
1. Extração do DNA de uma amostra
biológica (células ou tecido);
2. Fragmentação do DNA de elevado peso
molecular presente na amostra, recorrendo-se a enzimas de restrição;
3. Separação dos fragmentos de DNA obtidos
de acordo com o peso molecular, recorrendo-se a electroforese em gel de
agarose (no gel aparecerá um smear devido ao elevado número de
fragmentos presentes em cada amostra);
4. Desnaturação, ou separação, da cadeia
dupla do DNA tornando-o DNA de cadeia simples, para tal é necessário
tratar o gel onde foi realizada a electroforese com uma solução alcalina
(normalmente composta por NaOH – hidróxido de sódio). Esta etapa é
essencial uma vez que apenas DNA em cadeia simples tem a capacidade de
hibridar com a sonda e que algum RNA ainda existente na amostra é
destruído;
5. Transferência do DNA separado no gel
para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon, para tal é necessário
colocar a membrana sobre o gel e aplicar pressão uniformemente
distribuída sobre o gel, levando à ligação do DNA à membrana.
Seguidamente, a membrana é aquecida (no caso da utilização de uma
membrana de nitrocelulose) ou exposta a radiação UV (no caso da
utilização de uma membrana de nylon) para fixar permanentemente o DNA à
membrana;
6. Tratamento da membrana com a sonda, que
se define como uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples cuja
sequência é conhecida e complementar à sequência de DNA que se quer
estudar, tornando possível a hibridação por complementaridade entre a
sonda e a sequência de interesse. A sonda é marcada com átomos
radioativos, corante fluorescente ou uma enzima que gera sinal quando
entra em contato com um substrato, de forma a tornar possível a detecção
dos locais de hibridação.
7. Lavagem da membrana com o objetivo de
retirar toda a sonda que não hibridou, permanecendo na membrana apenas a
sonda que hibridou na totalidade por complementaridade de bases com a
sequência de interesse;
8. Detecção do padrão de hibridação, onde
se utiliza autoradiografia em filme de raio-X no caso das sondas
concebidas com átomos radioativos e corante fluorescente ou um método de
detecção cromogénico no caso das sondas concebidas com enzimas. No caso
de não ocorrer hibridação por não existir a sequência de DNA de
interesse na amostra em estudo, apenas o marcador molecular emitirá cor.
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