Conceito de Reação em Cadeia da
Polimerase
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR –
Polimerase Chain Reaction), desenvolvida em 1984 por Kary Mullis, é uma
técnica científica molecular simples, que se baseia na amplificação
rápida de sequências específicas de determinado ADN, sendo por isso
bastante utilizada por exemplo na deteção de microrganismos em amostras
de alimentos.
Este método de deteção baseia-se numa
reação enzimática, onde ciclos após ciclos, e em combinação com
temperaturas específicas, é permitido fazer cópias do ADN alvo de modo a
que este seja detetado posteriormente.
O procedimento é o seguinte:
1) A amostra a analisar é misturada com os
reagentes necessários para ocorrer a reação: enzima Taq DNA
polimerase, os quatro nucleótidos constituintes do ADN (adenina,
citosina, guanina e timina), os dois primers de iniciação e
magnésio (cofator essencial para o funcionamento da Taq DNA
polimerase);
2) A mistura é aquecida a altas
temperaturas (94°C) de forma a separar a dupla cadeia do ADN alvo – Fase
de desnaturação (Desnaturation);
3) A mistura é arrefecida até 40-55°C (é
chamada de temperatura de annealing que depende dos primers)
– Fase de emparelhamento dos primers. É nesta fase que os
primers se ligam á sequencia complementar e a cadeias opostas no ADN
alvo;
4) A temperatura da reação é elevada
(72°C) para que ocorra a polimerização das novas cadeias complementares
ao ADN alvo. Após os primers se ligarem, na etapa anterior, a
Taq DNA polimerase estende as sequências iniciadoras ligando os
nucleótidos entre si, completando assim as cadeias simples tornando-as
duplas – Fase de extensão (Extension);
Estas etapas são repetidas inúmeras vezes
(30 a 40) de forma a ser obtida uma amplificação exponencial do ADN alvo
capaz de ser detetada posteriormente através por exemplo da técnica de
eletroforese em gel de agarose.
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