Conceito de Primer
Primer
ou iniciador molecular refere-se a uma sequência de oligonucleótidos,
escrita sempre na direção 5`→3`, que marca as extremidades da sequência
de DNA alvo que se pretende sintetizar. Para tal, são necessários dois
primers: um complementar à sequência de DNA anti-sense (primer
sense – forward); e outo complementar à
sequência
de DNA sense (primer anti-sense – reverse). Por outras
palavras, a sequência flanqueada pelos iniciadores moleculares ou
primers é a secção do DNA que se amplifica. Os primers são
normalmente usados em Reações de DNA Polimerase em Cadeia (Polymerase
Chain Reaction, PCR) e uma vez formado o complexo, primer e
sequência de DNA alvo, a DNA polimerase liga-se ao grupo OH da
extremidade do carbono 3' do primer (extremidade 3' OH) para dar início
ao processo de síntese. Assim, o desenho de primers é um processo
extremamente crítico para o sucesso do PCR e deverá ter em conta os
seguintes critérios:
1.
A
região do
primer complementar à sequência do DNA template, deverá
ser de 17-28 pares de base (pb). Na prática, são comummente utilizados
primers com um comprimento de 18-30 pb.
2.
O
conteúdo
de G+C (Guanina+Citosina) deverá estar compreendido entre 40%-60% (G+C),
com distribuição homogénea de todas as bases ao longo do comprimento do
primer;
3.
A
terminação
3` deverá ser G ou C, GC ou CG;
4.
Não
deverão
ocorrer repetições invertidas no primer, ou sequências
auto-complementares com mais de 3 pb
seguidos,
de forma a evitar a formação de dímeros de primers;
5.
A
temperatura
de melting (Tm) deverá estar compreendida entre 52 ᴼC-62 ᴼC, e a Tm
calculada para o par de “primers” não deverá diferir em mais que 5 ᴼC.
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