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PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

Autor: João Figueiredo
Licenciado em Biologia

Data de criação: 28/03/2015

Resumo: Apresentação do conceito de PCR – Reação em Cadeia da Polimerase... A reação em cadeia da polimerase é uma técnica de biologia molecular, comumente designada por PCR (do inglês polymerase (...)

Palavras chave:  biologia

Conceito de PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

A reação em cadeia da polimerase é uma técnica de biologia molecular, comumente designada por PCR (do inglês polymerase chain reaction).

A PCR foi desenvolvida durante os anos 80, do século XX, pelo bioquímico Kary Banks Mullis, o que lhe valeu o prémio Nobel da Química, em 1993. A sua descoberta permitiu um elevado avanço na análise de DNA (ácido desoxirribonucleico). É uma técnica que tem por base a amplificação rápida e seletiva de um fragmento de DNA de interesse, amplamente utilizada nos dias de hoje, tanto no campo da biologia como da medicina.

Uma das principais importâncias desta técnica é a sua utilização quando a quantidade de DNA alvo é ínfima. O mecanismo usado na reação in vitro é análogo ao mecanismo que ocorre nos seres vivos, para a replicação de DNA.

Para o desenvolvimento deste procedimento foi de essencial importância o isolamento da enzima Taq polimerase. Esta enzima foi isolada de uma bactéria que vive a altas temperaturas, a Thermus aquaticus. Este fator é muito importante, pois a enzima é resistente a temperaturas elevadas, não sofrendo inatividade nos ciclos da PCR, onde a temperatura da reação ascende até aos 95 °C.

A preparação da amostra consiste em extrair o DNA e adicioná-lo a uma mistura (pré-mix), que contém os nucleótidos, os primers (iniciadores de cadeia) e a enzima polimerase. Esta mistura é colocada num aparelho, o termociclador, onde se dá através de ciclos, várias fases que vão permitir amplificar o segmento de DNA pretendido.

A reação consiste numa sequência de ciclo (normalmente entre 25 a 35 ciclos), cada ciclo compreende uma desnaturação da molécula de DNA, o emparelhamento dos primers e a síntese de DNA. Uma nota de elevada importância nesta técnica é a precaução sobre contaminações, se a amostra estiver contaminada com outro DNA, este também poderá ser amplificado, o que levará a erros nos resultados finais.

A desnaturação da molécula ocorre a uma temperatura de 95 °C, nesta fase as ligações entre as duas cadeias complementares de DNA, estabelecidas por pontes de hidrogénio, rompem-se e separam-se as duas cadeias simples. Após esta fase dá-se a ligação dos primers, que hibridam com a extremidade 3’ da cadeia de DNA. Os primers flanqueiam o DNA e ligam-se a este pois estão em concentrações muito elevadas, ao passo que o DNA está em concentrações diminutas. A baixa concentração de DNA é um fator preponderante ao não emparelhamento das cadeias complementares do DNA, uma vez que nesta fase a temperatura é de, aproximadamente, 55 °C. A partir do segmento onde se ligaram os primers e usando como molde a cadeia onde os esses estão emparelhados, dá-se então a síntese do DNA, mediada pela Taq polimerase. A temperatura nesta fase ronda os 72 °C. Este ciclo é repetido diversas vezes automaticamente, permitindo em alguns minutos aumentar a quantidade de DNA a partir de apenas uma cópia. Esta técnica permite que o DNA possa ser visualizado, posteriormente, em gel de agarose ou poliacrilamida.

Note-se que em cada n ciclo se produz 2ⁿ moléculas de DNA.