Conceito de Northern Blot
Northern blot diz respeito a uma técnica
utilizada na Biologia Molecular na qual é estudada a expressão genética
através da detecção de RNA mensageiro na amostra em análise. Esta
técnica torna possível averiguar se um gene está a ser transcrito em RNA
e quais os seus níveis de expressão durante as diferentes fases do ciclo
celular tanto em situações normais como em situações anormais de doença.
Tendo sido descrita por James Alwine, David Kemp, and George Stark, em
1977 na Universidade de Stanford, adotou o seu nome por ser uma variação
ao Southern blot. A técnica baseia-se na separação das moléculas de RNA
por peso molecular através de uma electroforese, seguindo-se a
transferência para uma membrana e a detecção da molécula de RNA
mensageiro de interesse por hibridação parcial de uma sonda específica.
Procedimento:
1. Extração do RNA de uma amostra
biológica (células ou tecido);
2. Desnaturação das moléculas de RNA para
se tornarem moléculas de estrutura primária, recorrendo-se à adição de
formaldeído no gel da electroforese;
3. Separação das moléculas de RNA
presentes na amostra de acordo com o seu peso molecular, através de uma
electroforese em gel (aparecerá um smear no gel devido ao elevado número
de moléculas de RNA presentes em cada amostra);
4. Transferência para membrana de
nitrocelulose ou de nylon, carregada positivamente, através de ação
capilar ou outros sistemas. Seguidamente, a membrana é aquecida (no caso
da utilização de uma membrana de nitrocelulose) ou exposta a radiação UV
(no caso da utilização de uma membrana de nylon) para fixar
permanentemente o RNA à membrana;
5. Tratamento da membrana com a sonda, que
se define como uma molécula de DNA ou RNA de cadeia simples cuja
sequência é conhecida e complementar à sequência (total ou parcial) de
RNA mensageiro que se quer estudar, tornando possível a hibridação por
complementaridade entre a sonda e a sequência de interesse. A sonda é
marcada com átomos radioativos, corante fluorescente ou uma enzima que
gera sinal quando entra em contato com um substrato, de forma a tornar
possível a detecção dos locais de hibridação;
6. Lavagem da membrana com o objetivo de
retirar toda a sonda que não hibridou, permanecendo na membrana apenas a
sonda que hibridou por complementaridade de bases com a sequência de
interesse;
7. Detecção do padrão de hibridação, onde
se utiliza autoradiografia em filme de raio-X no caso das sondas
concebidas com átomos radioativos e corante fluorescente ou um método de
detecção cromogénico no caso das sondas concebidas com enzimas. No caso
de não ocorrer hibridação por não existir a sequência de RNA mensageiro
de interesse na amostra em estudo, apenas o marcador molecular emitirá
cor.
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