Conceito de GFP - Proteína Verde
Fuorescente
A
proteína
verde fluorescente, GFP (do inglês Green Fluorescent Protein), é
a primeira proteína naturalmente fluorescente que foi identificada. A
sua descoberta revolucionou as ciências biológicas, permitindo
visualizar células, organelos e processos biológicos entre outros.
Estrutura e
propriedades bioquímicas
A GFP
é
uma pequena proteína constituída por 238 aminoácidos que formam onze
cadeias β antiparalelas, cujo conjunto forma um cilindro no centro do
qual encontra-se uma hélice α. Após ciclização e oxidação de três dos
aminoácidos da hélice central, os aminoácidos serina, tirosina e glicina
(nas posições 65, 66 e 67) forma-se um cromóforo, um grupo químico com
capacidade de absorver e emitir luz. Quando uma luz ultravioleta (UV) ou
azul incide no cromóforo, este absorve a luz e, a seguir, liberta
energia emitindo luz verde. As extremidades N-terminal e C-terminal da
GFP estão livres e acessíveis para ligação com outras proteínas.
A GFP é uma
proteína
estável, que tolera temperaturas até 65ºC e um pH de 5.5 a 12.2 e é
resistente a tratamentos prolongados com protéases. Não necessita de
substrato nem de co-fatores para fluorescer.
A forma monomérica da
GFP selvagem apresenta um pico de excitação a 395nm e um pico menor a
475nm, dando origem a uma
emissão única a
509nm, localizada na zona verde do espectro visível. A substituição da
serina (Ser65) pela treonina (Thr65) criou uma forma mutante e melhorada
da GFP, a EGFP (do inglês Enhanced Green Fluorescent Protein), 6
vezes mais fluorescente, que apresenta um pico predominante a 488nm e um
pico de emissão mantido a 509nm.
Descoberta
A GFP foi descoberta
em 1962, pelo investigador Osamu Shimomura e pelos seus colaboradores,
nos laboratórios Friday Harbor da Universidade de Washington, quando
estes estudavam a bioluminescência da medusa Aequorea victoria,
um cnidário presente no Oceano Pacífico ao largo da América do Norte.
Shimomura isolou e purificou uma proteína bioluminescente dependente do
cálcio, à qual deu o nome de aequorina (referente à medusa) e verificou
a presença de uma
outra proteína que apresentava uma forte fluorescência verde quando
exposta à luz UV. Esta proteína foi então designada de proteína verde
fluorescente ou GFP.
Verificaram
que quando a aequorina se liga ao cálcio, esta emite uma luz azul que,
por sua vez, é absorvida pela GFP levando à emissão de uma luz verde.
No final dos anos
1980, o investigador americano Martin Chalfie começou a trabalhar com a
GFP com o intuito de utilizar o gene desta proteína para visualizar a
ativação de outros genes e a subsequente produção de proteínas. Chalfie
e os seus colaboradores
identificaram a localização do gene responsável pela síntese da GFP no
genoma da Aequorea victoria. Em 1994, conseguiram incorporar este
gene, por manipulação genética, na bactéria Escherichia coli, a
qual passou a exibir a luz verde caraterística da GFP quando iluminada
com uma luz UV. A seguir, inseriram o gene da GFP no nematode
Caenorhabdistis elegans e conseguiram visualizar e entender pela
primeira vez o desenvolvimento das células nervosas.
Em 1996, um
outro grupo de
investigadores eliminaram os intrões do gene da GFP permitindo a sua
aplicação nas plantas.
Mais
tarde, Roger Y. Tsien ampliou o espectro cromático das proteínas
fluorescentes. A troca de aminoácidos na sequência da proteína da GFP
permitiu obter variantes nas regiões do azul (BFP), ciano (CFP) e
amarelo (YFP). A obtenção de uma fluorescência nas zonas do laranja e do
vermelho só foi possível após a descoberta, por Sergey Lukyanov, de
outra proteína semelhante à GFP mas com uma fluorescência vermelha. A
proteína DsRED (do inglês Desired RED protein) foi encontrada num
coral bioluminescente do género Discosoma. Tsien e os seus
colaboradores desenvolveram novas variantes da GFP, a partir desta
proteína, às quais deram nomes de frutos de acordo com a cor
apresentada: mPlum, mCherry, mStrawberry, mOrange e mCitrine.
Posteriormente, outros investigadores contribuíram para o alargamento do
espectro, permitindo a marcação com diferentes cores e a observação de
múltiplos processos em simultâneo.
Em 2008,
Osamu
Shimomura, Martin Chalfie e Roger Tsein foram galardoados com o Nobel da
Química, pela descoberta e pelo desenvolvimento de estudos e de
aplicações da GFP como marcador biológico.
Aplicações das
proteínas fluorescentes
As proteínas
fluorescentes
são muito versáteis e são utilizadas tanto em microbiologia como em
engenharia genética ou em fisiologia. Através de técnicas de ADN
recombinante, o gene da GFP (ou proteínas similares) pode ser
introduzido em culturas de células vivas ou em células específicas
presentes num organismo intacto.
São usadas como sondas
e, como tal, permitem a observação de processos até então invisíveis,
tais como o desenvolvimento dos neurónios, o crescimento e disseminar de
células cancerígenas, o desenvolvimento da doença de Alzheimer, o
crescimento de bactérias patogénicas, a proliferação do vírus da SIDA, o
processo de infeção de parasitas (por exemplo na doença de Chagas), a
evolução das primeiras células do embrião, entre muitos outros. Também
são aplicadas na área da biotecnologia ambiental na deteção de metais
pesados e trinitrotolueno (TNT) em poços ou furos de água. Neste caso,
utilizam-se bactérias geneticamente modificadas resistentes ao poluente
em questão e que passam a fluorescer na sua presença.
Fontes
Alberts,
B. et al. (2008). Molecular
biology of the cell. 5th ed. New York: Garland Science. p592-598.
Charlfie,
M. and Kain, S. R. (2006). Green
fluorescent protein: Properties, applications and protocols. 2nd ed.
New Jersey: Wiley - Interscience.
Lodish,
H. et al. (2004). molecular
cell biology. 5th ed. New York: W.H. Freeman. p188-189.
Xiao, J.
(2009).
Single-molecule imaging in living cells. In: Hinterdorfer, P. and Van
Oijen A. Handbook of single-molecule biophysics.
New York: Springer.
p46-84.
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