Conceito de Eletroforese de DNA em Gel
de Agarose
A
técnica de separação dos fragmentos de DNA mais comum é a
eletroforese de DNA em géis de agarose. A agarose é um
polissacárido que é dissolvido numa solução tampão quente e solidifica à
temperatura ambiente. A concentração de agarose determina o
tamanho dos poros da matriz de agarose solidificada. Uma maior
concentração de agarose faz com que os poros formados apresentem
menores dimensões, e por isso permitam a separação de fragmentos de
DNA mais
pequenos
com maior resolução.
A
eletroforese de DNA pode também ser realizada em gel de
acrilamida caso seja preciso obter uma melhor resolução dos fragmentos.
São aplicadas também outras variantes da eletroforese de DNA, tal
como a eletroforese pulsed-field (em campo pulsado), a fim
de separar grandes moléculas de DNA. Com esta técnica
eletroforética podem ser separadas grandes moléculas de DNA como
as de um cromossoma. Neste tipo de eletroforese é aplicada uma
corrente que alterna entre dois pares de elétrodos. As moléculas de
DNA percorrem o gel em ziguezague devido à reorientação que as
moléculas de DNA sofrem quando a corrente alterna. A reorientação
é mais rápida para moléculas menores. Assim, elas movem-se mais rápido e
são
separadas
das moléculas maiores.
Em
relação à eletroforese de DNA em gel em agarose, o DNA
previamente tratado é introduzido em pequenos poços de gel numa
das extremidades do gel de agarose, previamente formados com o
auxílio de um pente. Este gel encontra-se imerso em tampão num
tanque de eletroforese. Posteriormente, é então aplicada uma corrente
elétrica através do gel posicionado entre dois elétrodos. Como DNA
é carregado negativamente em pH neutro, é atraído para o elétrodo
positivo. Os fragmentos de DNA menores migram através de um gel
de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA
maiores. A velocidade de migração de uma molécula de DNA no gel
de agarose é determinada, principalmente, por: tamanho da
molécula de DNA, concentração de agarose, conformação do
DNA e a tensão aplicada. A relação entre o logaritmo do peso
molecular do DNA e a distância percorrida no gel é
aproximadamente linear. Assim é possível estimar o tamanho de fragmentos
de DNA se compararmos a sua distância de migração com a migração
de fragmentos de
tamanho
conhecido, normalmente, entre os 300 e os 10 000 pares de bases.
Posteriormente,
para a visualização do gel é possível utilizar brometo de etídio que é
aplicado depois da corrida, ou então GelRed ou outro substituto. Estes
químicos intercalam-se no DNA e após exposição a raios UV emitem
fluorescência.
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