Conceito de Cromatografia
A
cromatografia é uma
técnica de separação de componentes de uma mistura, entre uma corrente
de fluído em movimento, chamada fase móvel e uma fase estacionária
adjacente. A fase móvel pode ser um líquido ou um gás, enquanto que a
fase estacionária é um sólido ou um líquido.
O movimento
molecular troca
continuamente as moléculas do soluto entre as duas fases. Se, um soluto
particular favorece a distribuição do fluido em movimento, as moléculas
passam a maior parte do seu tempo a migrar com a corrente e será
transportado longe de outros compostos cujas moléculas são mantidas por
mais tempo na fase estacionária. Para um dado composto, a razão entre os
tempos gastos nas fases móvel e estacionária é igual à razão das suas
concentrações nestas regiões, conhecido como o coeficiente de partição.
Uma mistura de solutos é introduzida no sistema numa região confinada ou
zona estreita; a força motriz para a migração do soluto é o fluido em
movimento e a força de resistência é a afinidade para o soluto da fase
estacionária; a combinação destas forças são manipuladas pelo analista,
produzindo a separação.
A
cromatografia tem
numerosas aplicações em área biológicas e químicas. É amplamente
utilizada em pesquisa bioquímica para a separação e identificação de
compostos químicos de origem biológica. Na indústria do petróleo a
técnica é empregada para analisar misturas complexas de hidrocarbonetos.
Como um método de separação, a
cromatografia tem um número de vantagens sobre as técnicas de
cristalização mais antigas, como por exemplo a extração por solventes e
destilação. Algumas técnicas de cromatografia podem detetar substâncias
presentes na ordem de picogramas (10-12 gramas), tornando
assim o método uma excelente técnica de screening analítico,
usado na deteção de pesticidas clorados em materiais biológicos e no
ambiente e também na ciência forense para a deteção de drogas
terapêuticas e drogas de abuso.
A primeira aplicação puramente
pragmática da cromatografia foi realizada por químicos da tinturaria,
que testaram as suas
misturas de corantes
mergulhando cordas ou pedaços de pano em barris de tinta. A solução de
corante migrou até o material introduzido por ação capilar tendo os
componentes do corante produzido bandas de cor diferente.
A descoberta de cromatografia é
geralmente atribuída ao botânico russo Mikhail S. Tsvet, uma vez que em
1901 reconheceu a base físico-química da separação e aplicou-a de uma
forma racional e organizada para a separação dos
pigmentos vegetais,
especialmente os carotenóides e clorofilas. Tsvet descreveu uma técnica
que é usada hoje essencialmente da mesma forma. Embalou uma coluna
vertical de vidro com um material de adsorção, tais como alumina ou
sílica, adicionou uma solução de pigmentos da planta no topo da coluna,
e lavou os pigmentos através da coluna com um solvente orgânico. Os
pigmentos ficaram separados numa série de faixas coloridas discretas
sobre a coluna, divididos por regiões inteiramente livres de pigmentos.
Como Tsvet usou substâncias coloridas, designou o método de
cromatografia (das palavras gregas chroma que significa cor e
grafein que significa escrita). Em 1941, dois químicos britânicos,
Archer JP Martin e Richard LM Synge, começaram um estudo sobre a
composição de aminoácidos da lã, no qual utilizaram uma técnica chamada
distribuição contracorrente líquido-líquido, e que não conseguiu
dar-lhes a separação adequada; portanto, conceberam um método
alternativo, no qual um líquido estava firmemente ligado a um sólido
finamente granulado embalado num tubo de vidro e um segundo líquido,
imiscível com o primeiro. A técnica passou a ser chamado cromatografia
de partição. Este sistema inicial apresentou algumas dificuldades devido
à falta de uniformidade na embalagem de colunas. Em parte por este
motivo, Martin e os seus colegas de trabalho elaboraram um novo processo
no qual a forma estacionária era uma folha de papel de filtro. O papel
foi pensado como água ligado a celulose, fornecendo um outro método de
partição. A técnica deu a reprodutibilidade desejada, e o papel começou
a ter uma grande aplicação na análise de compostos biologicamente
importantes, tais como aminoácidos, esteróides, hidratos de carbono e
pigmentos.
Ainda
uma outra técnica
cromatográfica, a cromatografia gasosa, foi realizada pela primeira vez
na Áustria, em 1944, pelo químico Erika Cremer, que usou uma fase sólida
estacionária. A primeira grande exploração do método foi feita por
Martin e James em 1952, quando relataram a cromatografia em fase gasosa
de eluição de ácidos orgânicos e aminas. Neste trabalho, as pequenas
partículas de material de suporte foram revestidas com um líquido não
volátil e embalado num tubo de vidro aquecido. Misturas injetadas para
dentro do tubo e transportados através de um gás comprimido apareceram
em zonas bem separados. Este desenvolvimento foi imediatamente
reconhecido pelos químicos de petróleo como um método simples e rápido
de análise das misturas complexas dos hidrocarbonetos encontrados em
produtos petrolíferos.
Em
1957, ao fazer um estudo
teórico das colunas cromatográficas gasosas, Marcel JE Golay, como
consultor para a Perkin-Elmer Corporation, concluiu que uma coluna longa
(90 a 180 metros) de tubulação e de diâmetro estreito (diâmetro interno
de 0,25 milímetros) com a sua parede revestida com uma película fina de
líquido, iria produzir separações de qualidade superior. É agora
possível separar centenas de componentes de uma mistura numa única
experiência cromatográfica.
Outra técnica
cromatográfica é a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) que
depende: (1) do desenvolvimento de bombas, que conduzem a uma corrente
constante de líquido a alta pressão para a coluna e (2) detetores que
detetam as pequenas amostras. No início, apenas os sólidos de adsorção
foram utilizados como fase estacionária, porque os revestimentos
líquidos eram arrastados pela fase móvel. Existe ainda a cromatografia
de troca iónica que pode ser aplicada para separações de iões orgânicos
e tem uma importância especial para a separação de aminoácidos e ácidos
nucleicos.
Uma técnica que exibe
grande seletividade é a cromatografia de afinidade, que foi descrita
pela primeira vez por Pedro Cuatrecasas e pelos seus colaboradores em
1968. Nessas separações, uma biomolécula, tal como uma enzima liga-se a
um substrato ligado à fase sólida, enquanto que os outros componentes
são eluídos. Uma outra técnica de separação baseia-se no facto de que a
velocidade de um fluido através de um tubo não é uniforme. Foi
denominada de cromatografia de fase única porque não há nenhuma fase
estacionária. As suas principais aplicações são para polímeros e
material particulado. O método foi usado para separar células
biológicas, partículas sub-celulares, vírus, lipossomas, agregados de
proteína, cinzas voláteis e pigmentos.
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